STERILISASI EKSPLAN

Dari semua sumber kontaminasi, kontaminasi dari bahan tanam/eksplan merupakan yang paling sulit diatasi. Untuk itu diperlukan bahan sterilan yang tepat untuk menghilangkan kontaminan dari eksplan.
Kontaminan hidup dapat berupa cendawan, bakteri, serangga dan telurnya, tungau serta spora. Bila kontaminan ini tidak dihilangkan, maka pada media yang mengandung gula, vitamin dan mineral, dalam waktu singkat seluruh botol terpenuhi oleh kontaminan yang akhirnya mengakibatkan eksplan menjadi mati.

Sterilisasi eksplan dengan bahan sterilisasi adalah sebatas membersihkan debu, cendawan, bakteri dan kontaminan lain dari bagian permukaan eksplan atau disebut desinfestasi.

1) Macam-macam bahan sterilisasi dan fungsinya
Macam-macam bahan sterilisasi dan fungsinya tersaji pada Tabel 1.

Macam-macam Bahan Sterilisasi dan Fungsinya

No Nama Bahan Sterilisasi Fungsi
1. Deterjen Membersihkan kotoran/debu dari eksplan
2. Fungisida Membersihkan jamur/cendawan
3. Bakterisida Membersihkan bakteri
4. Alkohol 70 % dan 95 % Desinfektan
5. Sodium hipoklorik
dengan nama dagang
clorox atau bayclin Desinfektan
6. Mercury chlorit dengan
nama dagang sublimat 0,05 % Desinfektan
7. Tween-20 Agen pembasah
8. Antibiotik Desinfektan
9. Iodine/betadine Antiseptik



2) Memilih bahan sterilisasi
Dalam melakukan sterilisasi eksplan, pemilihan metode sterilisasi harus selektif, termasuk dalam hal ini adalah memilih bahan sterilisasi yang tepat.
Setiap bahan tanam mempunyai tingkat kontaminan permukaan yang berbeda, tergantung dari :
a) Jenis tanaman
b) Bagian tanaman yang dipergunakan
c) Morfologi permukaan (misalnya : berbulu atau tidak)
d) Lingkungan tumbuh (green house atau lahan)
e) Musim waktu mengambil (musim hujan/kemarau)
f) Umur tanaman (seedling atau tanaman dewasa)
g) Kondisi tanaman (sakit atau sehat)

Untuk itu tidak ada prosedur sterilisasi yang standar yang harus diperhatikan dalam sterilisasi bahan tanam, yang terpenting adalah bahwa kontaminan harus dihilangkan tanpa mematikan sel tanaman. Dalam memilih bahan sterilisasi untuk bahan tanam perlu diketahui apakah kontaminan berupa kontaminan eksternal atau kontaminan internal. Pada bahan tanam yang mengandung kontaminan eksternal dapat dipilih bahan sterilisasi yang dapat membersihkan permukaan luar bahan tanam, sedangkan pada bahan tanam dengan kontaminan internal yaitu kontaminan yang berasal dari jaringan tanaman itu sendiri, maka perlu diberi perlakuan antibiotik atau fungisida sistemik.

3) Prosedur sterilisasi eksplan dengan cara dibakar
Tidak semua jenis eksplan dapat disterilisasi dengan cara dibakar. Eksplan yang dapat disterilisasi dengan cara dibakar adalah eksplan yang terbungkus oleh jaringan luar misalnya pelepah, daging buah, atau kulit luar yang sangat tebal. Dengan demikian eksplan yang dibakar, bagian dalamnya tidak rusak atau mati. Contoh eksplan yang dapat disterilisasi dengan cara dibakar adalah buah anggrek, bonggol pisang, biji jarak, dan lain-lain. Pembakaran eksplan jaringan jangan sampai merusak eksplan.

Prosedur sterilisasi eksplan dengan cara dibakar adalah eksplan dicelupkan kedalam alkohol absolut, eksplan dibakar pada api lampu bunsen,dan eksplan siap diinokulasi.

4) Mensterilkan eksplan dengan cara merendam bahan kimia
Pada dasarnya semua jenis eksplan dapat disterilisasi dengan menggunakan bahan kimia. Hanya saja perlu diperhatikan konsentrasi larutan bahan kimia yang digunakan serta lamanya perendaman. Keras lunaknya eksplan berpengaruh terhadap penggunaan konsentrasi larutan dan lamanya perendaman. Eksplan yang lunak sebaiknya menggunakan konsentrasi bahan kimia yang rendah dan waktu yang tidak terlalu lama. Sebaiknya pada eksplan yang keras, dapat digunakan konsentrasi yang lebih tinggi dan waktu perendaman yang lama.

Prosedur sterilisasi eksplan dengan cara merendam dalam bahan kimia adalah eksplan dicuci dengan deterjen dan dibilas air bersih,eksplan direndam dengan fungisida, eksplan dicuci dengan aquades steril, eksplan direndam dalam larutran antiseptik, dan eksplan siap diinokulasi.

Laporan Praktikum Bioteknologi Pembuatan Media Kultur Jaringan

BAB I

PENDAULUAN

 1.1  Latar Belakang
Media merupakan faktor utama dalam perbanyakan dengan kultur jaringan. Keberhasilan perbanyakan dan perkembangbiakan tanaman dengan metode kultur jaringan secara umum sangat tergantung pada jenis media. Media tumbuh pada kultur jaringan sangat besar pengaruhnya terhadap pertumbuhan dan perkembangan eksplan serta bibit yang dihasilkannya. Oleh karena itu, macam-macam media kultur jaringan telah ditemukan sehingga jumlahnya cukup banyak. Nama-nama media tumbuh untuk eksplan ini biasanya sesuai dengan nama penemunya. Media tumbuh untuk eksplan berisi kualitatif komponen bahan kimia yang hampir sama, hanya agak berbeda dalam besarnya kadar untuk tiap-tiap persenyawaan. Pembuatan media pada prinsipnya dilakukan dengan melarutan semua komponen media dalam air sesuai dengan konsentrasi pada permulasi yang diinginkan, penimbangan komponen media satu persatu untuk setiap pembuatan media kultur tidak praktis dan hanya dapat dilakukan jika jumlah zatnya cukup besar, masalah tersebut dapat diatasi dengan pembuatan larutan stok.
1.2  Tujuan

1. Untuk mengetahui jenis-jenis media kultur
2. Untuk mengetahui sifat dan komposisi pembuatan media
3. Untuk mengetahui teknik aseptic pembuatan media
4. Untuk mengetahui dan memahami rumus perhitungan larutan stok.

1.3  Manfaat
Dari praktikum yang dilakukan diharapkan mahasiswa dapat mengetahui sifat media kultur jaringan dan pemanfaatnya serta mampu membuat media kultur jaringan.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

 2.1 Jenis-jenis Media
a)      Media Knop
Dapat juga digunakan untuk menumbuhkan kalus wortel. Kultur kalus, biasanya ditumbuhkan pada media dengan kosentrasi garam-garam yang rendah seperti dalam kultur akar dengan penambahan suplemen seperti glucosa, gelatine, thiamine, cysteine-HCl dan IAA.
b)      Media White
Dikembangkan oleh Hildebrant untuk keperluan kultur jaringan tumor bunga matahari, ditemukan bahwa unsur makro yang dibutuhkan kultur tersebut, lebih tinggi dari pada yang dibutuhkan oleh kultur tembakau. Unsur F, Ca, Hg dan S pada media untuk tumor bunga matahari ini, sama dengan media untuk jaringan normal yang dikembangkan kemudian. Konsentrasi NO3- dan K+ yang digunakan Hildebrant ini lebih tinggi dari media white, tetapi masih lebih rendah dari pada media-media lain yang umum digunakan sekarang.
c)   Media Knudson dan media Vacin and Went
Media ini dikembangkan khusus untuk kultur anggrek. Tanaman yang ditanam di kebun dapat tumbuh dengan baik dengan pemupukan yang hanya mengandung N dari Nitrat. Knudson pada tahun 1922, menemukan penambahan 7.6 mM NH4+ disamping 8.5 mM NO3-, sangat baik untuk perkencambahan dan pertumbuhan biji anggrek. Penambahan NH4+ ternyata dibutuhkan untuk perkembangan protocorm. Media Nitsch & Nitsch, menggunakan NO3- dan K+ dengan kadar yang cukup tinggi untuk mengkulturkan jaringan tanaman artichoke Jerussalem. Penambahan ammonium khlorida sebanyak 0.1 mM, menghasilkan pertumbuhan jaringan yang menurun. Pertumbuhan sel dari jaringan suatu organ dibandingkan dengan jaringan tumor tanaman Venca rosea (Catharanthus roseus), menunjukkan bahwa penambahan ammonium ke dalam media White yang sudah dimodifikasi, mempunyai pertumbuhan yang lebih baik. Konsentrasi NO3-, NH4-, K+ dan H2PO4- yang diperoleh, hampir sama dengan yang dikembangkan oleh Miller.
d)   Media Murashige & Skoog (media MS)
Merupakan perbaikan komposisi media Skoog, terutama kebutuhan garam anorganik yang mendukung pertumbuhan optimum pada kultur jaringan tembakau. Media MS mengandung 40 mM N dalam bentuk NO3 dan 29 mM N dalam bentuk NH4+. Kandungan N ini, lima kali lebih tinggi dari N total yang terdapat pada media Miller, 15 kali lebih tinggi dari media tembakau Hildebrant, dan 19 kali lebih tinggi dari media White. Kalium juga ditingkatkan sampai 20 mM, sedangkan P, 1.25 mM. Unsur makro lainnya konsentrasinya dinaikkan sedikit. Pertama kali unsur-unsur makro dalam media MS dibuat untuk kultur kalus tembakau, tetapi komposisi MS ini sudah umum digunakan untuk kultur jaringan jenis tanaman lain. Media MS paling banyak digunakan untuk berbagai tujuan kultur pada tahun-tahun sesudah penemuan media MS, sehingga dikembangkan media-media lain berdasarkan media MS tersebut, antara lain media :

1.  Lin & Staba, menggunakan media dengan setengah dari komposisi unsur makro MS, dan     memodifikasi : 9 mM ammonium nitrat yang seharusnya 10mM, sedangkan KH2 PO4 yang dikurangi menjadi 0.5 Mm, tidak 0.625 mM. Larutan senyawa makro dari media Lin & Staba, kemudian digunakan oleh Halperin untuk penelitian embryogenesis kultur jaringan wortel dan juga digunakan oleh Bourgin & Nitsch (1967 dalam Gunawan 1988) serta Nitsch & Nitsch (1969 dalam Gunawan 1988) dalam penelitian kultur anther.
2.   Modifikasi media MS yang lain dibuat oleh Durzan et alI (1973 dalam Gunawan 1988) untuk   kultur suspensi sel white spruce dengan cara mengurangi konsentrasi K+ dan NO3-, dan menambah konsentrasi Ca2+ nya.
3.  Chaturvedi et al (1978) mengubah media MS dengan menurunkan konsentrasi NO3-, K+, Ca2+, Mg2+ dan SO4-2 untuk keperluan kultur pucuk Bougainvillea glabra.

Senyawa-senyawa di dalam media MS dapat terjadi pengendapan persenyawaan, ini terlihat jelas pada media cair. Kebanyakan dari persenyawaan yang mengendap adalah fosfat dan besi, kemudian dalam jumlah yang lebih sedikit adalah Ca, K, N, Zn dan Mn. Senyawa paling sedikit adalah senyawa yang mengandung unsur C, Mg, H, Si, Mo, S, Ca dan Co. Setelah tujuh hari dibiarkan, maka kira-kira 50% dari Fe dan 13% dari PO4+, mengendap (Dalton et al, 1983). Pengendapan unsur-unsur tersebut mungkin tidak penting, karena unsur-unsur tersebut masih tersedia bagi jaringan tanaman dan pengaruh pengendapannya belum diketahui. Untuk mengatasi pengendapan Fe, Dalton dan grupnya menganjurkan supaya konsentrasi Fe dikurangi sampai 1/3 dengan EDTA yang tetap.

5.      Media Gamborg B5 (media B5)
Pertama kali dikembangkan untuk kultur kalus kedelai dengan konsentrasi nitrat dan amonium lebih rendah dibandingkan media MS. Untuk selanjutnya media B5 dikembangkan untuk kultur kalus dan suspensi, serta sangat baik sebagai media dasar untuk meregenerasi seluruh bagian tanaman.. Pada masa ini media B5 juga digunakan untuk kultur-kultur lain. Media ini dikembangkan dari komposisi PRL-4, media ini menggunakan konsentrasi NH4+ yang rendah, karena konsentrasi yang lebih tinggi dari 2 mM menghambat pertumbuhan sel kedelai. Fosfat yang diberikan setelah 1 mM, Ca2+ antara 1-4 mM, sedangkan Mg2+ antara 0.5-3 mM (Gamborg et al, 1968).

6.      Media Schenk & Hildebrant (media SH)
Merupakan media yang juga cukup terkenal, untuk kultur kalus tanaman monokotil dan dikotil. Konsentrasi ion-ion dalam komposisi media SH sangat mirip dengan komposisi pada media Gamborg dengan perbedaan kecil yaitu level Ca2+, Mg2+, dan PO4-3 yang lebih tinggi. Schenk & Hildebrant mempelajari pertumbuhan jaringan dari 37 jenis tanaman dalam media SH dan mendapatkan bahwa: 32 % dari spesies yang dicobakan, tumbuh dengan sangat baik, 19% baik, 30% sedang, 14% kurang baik, dan 5% buruk pertumbuhannya. Tetapi karena zat tumbuh yang diberikan pada tiap jenis tanaman tersebut berbeda. Media SH ini cukup luas penggunaannya, terutama untuk tanaman legume.

7.      Media WPM (Woody Plant Medium)
Yang dikembangkan oleh Lioyd & Mc Coen pada tahun 1981, merupakan media dengan konsentrasi ion yang lebih rendah dari media MS. Media diperuntukkan khusus tanaman berkayu, dan dikembangkan oleh ahli lain, tetapi sulfat yang digunakan lebih tinggi dari sulfat pada media WPM. Saat ini WPM banyak digunakan untuk perbanyakan tanaman hias berperawakan perdu dan pohon-pohon.

8.      Media N6
Media N6 mempunyai ciri perbandingan NH₄⁺ dan NO₃⁻  yang jauh perbandinganya. Amonium  yang diberikan dalam bentuk (NH₄)SO₄ hanya sebanyak 363 mg/l, sedangkan KNO₃ 2830 mg/l.

(Suryowinoto, M. 1991)

2.2 Komposisi dan Fungsi Dasar dalam Media MS
a. Air
Air merupakan komponen yang penting di dalam pengkulturan eksplan karena 95% dari medium mengandung air. Air yang digunakan yaitu air destilasi, dimana air tersebut telah steril dari kontaminasi mikroorganisme atau substansi yang dapat merusak proses perkembangan eksplan.
b. Larutan garam anorganik
Tiap tanaman memerlukan setidaknya 6 elemen mikronutrien N, P, K, Mg, Ca, S, dan elemen yaitu Fe, Mn, B, Mo, Cl. Pereduksi CU^2- menjadi Cu^- bermanfaat pada perkembangan dan perbaikan vitamin adalah bahan yang perlu ditambahkan sebab tumbuhan yang dikulturkan belum mampu membuat vitamin sendiri, biasanya yang ditambahakan yaitu vitamin B, asam nukleat, pridosin (vitamin B6).
c. Zat-zat organic
Senyawa organic yang dipakai yaitu karbohidrat yang tersusun atas unsur-unsur C, H, O sebagai elemen penyusun utama karbohidrat mempunyai fungsi utama yaitu sebagai sumber energy untuk keseimbangan tekanan osmotic.

(Sanawaria, 2008)

 2.3 Teknik Aseptik dalam Pembuatan Media
a. Sterilisasi peralatan

• Sterilisasi peralatan (glassware dan logum) dan aquades dilakukan dengan sterilisasi kering (oven 130⁰c-170⁰c selama 2-4 jam).
• Sterilisasi peralatan dengan autoclave dilakukan pada suhu 121⁰c takanan 15 PSI selama 1 jam.
• Sterilisasi peralatan logam (pinset, gunting, jarum) yang digunakan dengan merendam perakitan tsb dalam alcohol 95% diikuti dengan pembakaran dan pendinginan.

b. sterilisasi medium kultur

• Metode autoclave

Medium dalam botol kultur ditutup dengan alumunium foil pada suhu 121⁰ C, tekanan PSI selama 15-40 menit dari waktu medium mencapai suhu yang diperlukan.

• Metode Filtrasi

Yaitu sterilisasi menggunakan membrane filter berukuran 0,45-0,22 mm di dalam kontiener steril.

(Sriyanti, 1994)

2.4 Rumus Perhitungan Larutan Stok
Volume stok untuk setiap pembuatan media q liter.

 V₁ X M₁ = V₂ x M₂

 Ket: V1 = Volume stok yang dicari.
V2 = Volume larutan stok
M1 = Konsentrasi larutan stok
M2 = Konsentrasi yang diinginkan.

(Hemawan dan Na”em, 2006)

BAB III

METODOLOGI

3.1  Alat, Bahan dan Fungsi

• Alat :

1. 14 botol kultur : berfungsi sebagai tempat media kultur
2. 2 pak karet gelang : berfungsi untuk penutup atau tali penutup plastik dan alumunium
3. Plastik tahan tanas (untuk 8 botol, dengan ukuran pxl; 12 x 13 cm) : sebagai penutup botol kultur (perlakuan a)
4. Gelas ukur : untuk mengukur cairan yang di butuhkan
5. Mikro pipet : untuk mengambil larutan stok dengan ukuran terkecil mikro meter
6. Beaker glass : untuk tempat pembuatan larutan stok
7. pH universal (indikator pH) : untuk mengukur pH larutan
8. sitter : megaduk larutan
9. microwave : untuk memasak larutan hingga larutan mengental
10. alumanium foil (unutk 6 botol, dengan ukuran pxl; 24 x 15, kertas di lipat/rangkap) : sebagai penutup botol kultur (perlakuan b)
11. autoclave : sterilisasi botol kultur sebelum di masukkan ke ruangan pengamatan
12. Timbangan analitik : untuk menimbang berat bahan yang diperlukan
    1. Oven : sterilisasi kering botol kultur

• bahan :

1. Aquades        : 50 ml (bahan tambahan pada

larutan stok)

1. Makro             : 30 ml

Mikro A          : 3 ml
Mikro B          : 0,3 ml                      sebagai bahan
FeEDTA          : 3 ml                         pembuatan larutan stok
Vitamin          : 0,3 ml
CaCl₂                        : 3 ml

1. Sukrosa                                  : untuk 300 ml. Larutan media

digunakan 9 gram gula. (untuk
membuat larutan menjadi
tercampur rata)

1. Agar-agar                              : unutk 300 ml. Larutan media

digunakan 2,1 gram agar-agar
(untuk mengentalkan larutan)
3.2          Cara Kerja Pembuatan Media Kultur (Diagram Alir)

Bilas gelas dengan menggunakan aquades

Isi gelas dengan aquades kurang lebih 50 ml

Masukkan sukrosa (gula) 9 gram dan agar-agar 2,1 gram                                                                                    Agar-agar            : 2,1 gram

Stirer (aduk) beberapa menit sampai larutan berwarna bening

Tutup dengan plastik wrap dan di lubangi

Mikrowave selama 7 menit

Masukkan ke dalam botol kultur @20 ml : 8 botol dengan tutup plastik 6 botol dengan tutup alumunium

Autoclave

Tambahkan aquades hingga volume mencapai 300 ml

Stirer (aduk) dan ukur pH (pH indikator)

Tambahkan unsur-unsur yang sudah di stok                       Makro   : 30 ml, Mikro A : 3 ml, Mikro B   : 0,3 ml, Fe EDTA     : 3 ml, Vitamin   : 0,3 ml, CaCl2        : 3 ml

3.3 Analisis perlakuan
Sebelum pembuatan media hal yang pertama kali dilakukan adalah mensterilkan semua peralatan yang akan digunakan dengan alcohol 95% serta diiuti dengan pembakaran kemudian didinginkan, hal ini bertujuan agar alat tidak terkontaminasi dengan jamur atau bakteri.
Isi breaker glas dengan larutan aquades kurang lebih 50 ml. Setelah itu, tambahkan unsur-unsur larutan yang sudah di stok, yaitu : makro (30 ml), mikro A (3 ml), mikro B (0,3 ml), Fe EDTA (3 ml), Vitamin (0,3 ml) dan CaCl₂ (3 ml). Setelah semua larutan selesai ditambahkan, tambahkan lagi aquades hingga volume mencapai 300 ml. Stirer (aduk) larutan dan ukut pH larutan menggunakan indikator pH hingga mencapai pH sekitar 5 – 6. Masukkan sukrosa (9 gram) dan agar-agar (2,1 gram) yang bertujuan untuk melarutkan larutan dan mengentalkan larutan. Stirer kembali sampai larutan berwarna putih bening. Setelah selesai, tutup breaker glas dengan plastik wrap dan masukkan ke dalam microwave selama 7 menit setelah selesai, masukkan larutan ke dalam botol kultur dengan 8 botol di tutup plastik, dan 6 botol ditutup alumunium. Masukkan ke autoclave untuk sterilisasi akhir, dan amati selama 2 minggu, apakah terjadi kontaminasi atau tidak, catat hasil.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1  Hasil

1. a.      Tabel media kultur dengan penutup plastic

NO	Hari Pengamatan ke-	Botol ke-	Jenis Kontaminan	Keterangan
1.	Kamis, 11 oct 2012	1 2 3 4 5 6 7 8	-	Tidak ada yang terkontaminasi
2.	Kamis, 18 oct 2012	1 2 3 4 5 6 7 8	-	Tidak ada yang terkontaminasi
3.	Selasa, 23 oct 2012	1 2 3 4 5 6 7 8	-	Tidak ada yang terkontaminasi
4.	Rabu, 31 Oct 2012	1 2 3 4 5 6 7 8	-	Tidak ada yang terkontaminasi
5.	Jum’at, 02 Nop 2012	1 2 3 4 5 6 7 8	-	Tidak ada yang terkontaminasi

1. b.      Tabel media kultur dengan penutup alumunium poli

NO	Hari Pengamatan ke-	Botol ke-	Jenis Kontaminan	Keterangan
1.	Kamis, 11 oct 2012	1 2 3 4 5 6	-	Tidak ada yang terkontaminasi
2.	Kamis, 18 oct 2012	1 2 3 4 5 6	-	Tidak ada yang terkontaminasi
3.	Selasa, 23 oct 2012	1 2 3 4 5 6	-	Tidak ada yang terkontaminasi
4.	Rabu, 31 Oct 2012	1 2 3 4 5 6	-	Tidak ada yang terkontaminasi
5.	Jum’at, 02 Nop 2012	1 2 3 4 5 6	-	Tidak ada yang terkontaminasi

4.2  Pembahasan
Pada praktikum kali ini kita kita mencoba membuat media kultur jaringan dengan bahan-bahan yang sudah dijelaskan di atas, setelah di autoklaf kita mengamati perkembangan media pada hari kamis tanggal 11 oktber, disana terlihat bahwa media yang ditutup dengan plastic dan alumunium poli keadaan semuanya masih baik, dengan tanda-tanda tidak ada perubahan warna (tetap putih) dan juga masih kelihatan stabil dengan kata lain tidak terlihat danya jamur pathogen yang masuk.
Kemudian pada hari kamis tanggal 18 oktober kita mengamati lagi dan ternyata tidak jauh berbeda dengan yang pengamatan pertama jadi semua media baik 8 sample yang ditutpi plastic dan 6 sample yang ditutupi alumunium tidak ada tanda-tanda terkontaminasi, tetapi disini ada satu media yang tertutupi alumunium yang kelihatan warnanya agak kekuningan tetapi menurut saya masih dalam keadaan tidak terkontaminasi karena ketika begitu sample didekatkan warnanya masih putih sebenarnya cuma memang dari jauh kelihatan agar sedikit kekuningan, seandainya itu termasuk dalam tanda kontaminasi tidak mungkin sebab saya melihat sample praktikan lain ada yang kuning tetapi disitu ada jamur yang menggelembung (membentuk bundaran) yang berwarna hitam ke abu-abuan, sedangkan pada sample kami tidak sedemikian itu.
Begitupun pada pengamatan ke-3 pada hari selasa tanggal 23 oktober 2012 kami menyimpulkan tidak ada yang terkontaminasi, begitu juga pada saat pengamatan ke-4 hari rabu, tanggal 31 oct 2012. Hingga pada pengamatan yang terakhir pada hari jum’at tanggal 02 nop 2012, ke 8 sample media kultur jaringan yang ditutupi plastic tidak terlihat adanya kontainasi begitupun ke 6 sample yang ditutupi alumunium.
Seperti apa yang dikemukakan oleh Andria bin Muhayat bahwa “eksplan yang terkontaminasi akan menunjukkan gejala seperti berwarna putih sampai biru (disebabkanjamur) atau busuk (disebabkan bakteri)

BAB V

PENUTUP

5.1 Kesimpulan
Media merupakan faktor utama dalam perbanyakan dengan kultur jaringan. Keberhasilan perbanyakan dan perkembangbiakan tanaman dengan metode kultur jaringan secara umum sangat tergantung pada jenis media. Media MS mengandung 40 mM N dalam bentuk NO3 dan 29 mM N dalam bentuk NH4+. Dan Media MS inilah yang paling banyak digunakan untuk berbagai tujuan kultur pada tahun-tahun sesudah penemuan media MS.

Pada praktikum kali ini kita mencoba membuat media tanam kultur jaringan dengan jenis media MS tersebut, dan akhirnya dapat ditarik kesimpulan ketika kita sudah melakukan beberapa kali pengamatan, media kultur jaringan yang ditutup dengan plastic biasa tepatnya ada 8 sampel dan 6 sampel yang ditutupi alumunium foil semuanya tidak terkontaminasi, masih putih normal

DAFTAR PUSTAKA

• Herawan, T dan M. Na’iem. 2006. Pengaruh Jenis Media dan Konsentrasi Zat Pengatur Tumbuh Terhadap Perakaran pada Kultur Jaringan Cendana (Santalum album Linn.). Jurnal Agrosains 19(2) : 103-109.
• Sasnawaria, 2005. Mikrobiologi dasar. Papa sinar sinantris. Jakarta.
• Sriyanti, Daisy P. 1994. Teknik Kultur Jaringan. Kanisius. Yogyakarta.
• Suryowinoto, M. 1991. Budidaya Jaringan dan Manfaatnya. Fakultas Biologi. Universitas Gadjah Mada. Yogyakart

Laporan Pengenalan dan Sterilisasi Alat Kultur Jaringan

I.      PENDAHULUAN

1.1.        Latar Belakang

Bioteknologi merupakan pemanfaatan makhluk hidup untuk mengubah bahan menjadi produk dan jasa dengan menggunakan prinsip-prinsip ilmiah. Tumbuhan memiliki sifat totipotensi yang besar, sedangkan hewan memiliki sifat totipotensi yang kecil, tapi pada saat fase embrio hewan memiliki sifat totipotensi yang besar.

Kultur jaringan adalah menumbuhkan sel atau jaringan pada medium tertentu dalam kondisi suci hama(aseptis), melalui kultur sel perbanyakan tumbuhan/hewan dapat dilakukan secara cepat, jumlahnya terbatas, hemat tempat dan waktu, serta memiliki sifat identik. Perbanyakan itu melalui teknik kloning (reproduksi sexual). Kultur sel tumbuhan dapat ditumbuhkan menjadi individu baru, sedangkan kultur sel hewan tidak bisa.

Alat-alat yang digunakan dalam kultur jaringan harus steril. Maka dari itu dalam laboratorium bioteknologi terdapat ruangan- ruangan khusus yaitu ruang sterilisasi, ruang media, laboratorium, ruang dokumentasi, dan laboratorium produksi kultur. Dalam ruang sterilisasi terdapat botol kultur, cawan petridish, oven, tabung reaksi, autoclave, kompor listrik, dan inkubator. Dalam ruang media terdapat botol-botol kultur yang berisi media yang tempatkan pada rak penyimpanan khusus. Dalam laboratorium terdapat timbangan analitik dan pipet micron. Dalam ruang dokumentasi terdapat pH meter. Dan dalam laboratorium produksi kultur terdapat laminar air flow.

Maka berdasarkan hal tersebut di atas, perlu di lakukan pengenalan alat-alat dalam pembuatan media kultur jaringan. Hal ini di harapkan dapat membantu jalannya praktikum selanjutnya yaitu pembuatan media.

1.2.        Tujuan dan kegunaan

Tujuan dari praktikum ini yaitu untuk mengetahui alat-alat yang digunakan dalam kultur jaringan dan sterilisasinya.

Kegunaan dari praktikum ini yaitu sebagai bahan informasi bagi pembaca khususnya mahasiswa dalam mempelajari kultur jaringan.

II.   TINJAUAN PUSTAKA

            Kultur jaringan merupakan salah satu cara perbanyakan tanaman secara vegetatif. Kultur jaringan merupakan teknik perbanyakan tanaman dengan cara mengisolasi bagian tanaman seperti daun, mata tunas, serta menumbuhkan bagian-bagian tersebut dalam media buatan secara aseptik yang kaya nutrisi dan zat pengatur tumbuh dalam wadah tertutup yang tembus cahaya sehingga bagian tanaman dapat memperbanyak diri dan bergenerasi menjadi tanaman lengkap (Tribowo, 2008).

Metode kultur jaringan dikembangkan untuk membantu memperbanyak tanaman, khususnya untuk tanaman yang sulit dikembangbiakkan secara generatif. Bibit yang dihasilkan dari kultur jaringan mempunyai beberapa keunggulan, antara lain: mempunyai sifat yang identik dengan induknya, dapat diperbanyak dalam jumlah yang besar sehingga tidak terlalu membutuhkan tempat yang luas, mampu menghasilkan bibit dengan jumlah besar dalam waktu yang singkat, kesehatan dan mutu bibit lebih terjamin, kecepatan tumbuh bibit lebih cepat dibandingkan dengan perbanyakan konvensional (Zulkarnain, 2009).

Sterilisasi adalah bahwa segala kegiatan dalam kultur jaringan harus dilakukan di tempat yang steril, yaitu di laminar flow dan menggunakan alat-alat yang juga steril. Sterilisasi juga dilakukan terhadap peralatan, yaitu menggunakan etanol yang disemprotkan secara merata pada peralatan yang digunakan. Teknisi yang melakukan kultur jaringan juga harus steril (Aryulina, 2004).

   Alat-alat yang digunakan dalam kultur jaringan yaitu botol kultur, cawan petridish, oven, tabung reaksi, autoclave, kompor listrik, incubator, Erlenmeyer, rak penyimpanan media, timbangan analitik, pipet micron, pH meter dan laminar air flow (Anonim, 2011).

Fungsi dari botol kultur yaitu tempat untuk mengkulturkan atau menanam eksplan. Cawan petridish berfungsi sebagai tempat untuk memotong-motong eksplan yang akan di tanam dalam botol kultur. Oven berfungsi sebagai alat sterilisasi kering. Tabung reaksi digunakan pada saat mengerjakan isolasi protoplas dan isolasi khloroplas. Autoclave berfungsi untuk mensterilkan bahan atau alat yang pada umumnya terbuat dari logam, plastik, karet, tekstil gelas juga liquid (cairan) dalam keadaan terbungkus maupun tidak. Kompor listrik untuk pemanas saat memasak media. Inkubator berfungsi untuk mensterilisasi alat dan bahan yang akan digunakan dalam praktikum. Erlenmeyer berfungsi sebagai alat penampung bahan yang akan dipanaskan. Rak penyimpanan media berfungsi sebagai tempat untuk menyimpan media yang telah jadi. Timbangan analitik berfungsi sebagai alat untuk menimbang nutrisi. Pipet micron berfungsi untuk mengambil nutrisi yang akan diberikan pada media. pH meter berfungsi untuk mengukur pH suatu media. Dan laminar air flow berfungsi sebagai tempat untuk sterilisasi media (Anonim, 2010)

            Botol-botol kultur, tabung reaksi, erlenmeyer dan cawan petridish yang dipergunakan sebagai wadah kultur jaringan biasanya disterilisasi dalam oven. Botol-botol yang sudah dicuci bersih dimasukkan dalam oven dan dipanaskan selama 4 jam pada temperatur 160°C. Setelah disterilisasi dapat langsung digunakan. Bila botol akan disimpan untuk beberapa lama maka sewaktu sterilisasi, mulut botol harus ditutup dengan aluminium foil (Anonim, 2010).

            Alat sterilisasi baik media maupun peralatan yang digunakan untuk proses isolasi dan penanaman eksplan yang sering digunakan adalah autoklaf. Tipe autoklaf yang dapat digunakan untuk sterilisasi ada bermacam-macam, mulai dari yang sederhana sampai digital (terprogram). Autoklaf yang sederhana menggunakan sumber uap dari pemanasan air yang ditambahkan ke dalam autoklaf. Pemanasan air dapat menggunakan kompor atau api Bunsen. Dengan autoklaf sederhana ini, tekanan dan temperatur diatur dengan jumlah panas dari api (Anonim, 2011).

III. METODOLOGI

3.1.      Tempat dan Waktu

            Praktikum pengenalan alat dan sterilisasi ini dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan, Prodi Agroekoteknologi Fakultas Pertanian Universitas Trunojoyo Madura, Bangkalan pada Hari Kamis, 14 Maret 2011 pukul 16.00 sampai selsai.

3.2.      Alat dan Bahan

   Alat yang diperkenalkan dalam praktikum ini yaitu botol kultur, cawan petridish, oven, tabung reaksi, autoclave, kompor listrik, incubator, erlenmeyer, rak penyimpanan media, timbangan analitik, pipet micron, pH meter dan laminar air flow. Adapun bahan yang diperkenalkan yaitu label, tissue dan bahan media untuk biakan.

3.3.      Prosedur Kerja

            Adapun prosedur kerja yang dilakukan dalam praktikum ini yaitu:

1.    Praktikan mengikuti asisten masuk dalam ruangan.

2.    Asisten menjelaskan alat-alat yang digunakan dalam kultur jaringan

3.    Praktikan mencatat nama alat dan fungsi masing-masing alat tersebut

4.    Memindahkan catatan tersebut pada buku penuntun

5.    Memeriksakan pada asisten

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1.      Hasil

No.	Alat Dan Bahan		Fungsi	Metode Sterilisasi
1.	Botol Kultur		Berfungsi sebagai tempat untuk mengkulturkan atau menanam eksplan	Srerilisasi kering
2.	Cawan Petri		Berfungsi sebagai tempat untuk memotong-motong eksplan yang akan ditanam dalam botol kultur	Srerilisasi kering
3.	Oven		Berfungsi sebagai alat untuk mensterilisasi alat yang akan digunakan dalam media kultur	Sterilisasi Kering
4.		Tabung Reaksi	Digunakan pada saat mengerjakan isolasi protoplas dan isolasi kloroplas	Srerilisasi kering
5.	Autoclave		Berfungsi untuk mensterilisasi ahan atau alat yang pada umumnya terbuat dari logam, plastik dll. Dalam keadaan terbungkus maupun tidak	Sterilisasi basah
6.	Kompor Listrik		Berfungsi untuk pemanas saat memasak media
7.	Inkubator		Untuk mensterilisasi alat dan bahan yang akan digunakan dalam praktikum	Sterilisasi kering
8.	Erlenmeyer		Berfungsi seagai tempat untuk memanaskan media yang akan dibuat	Srerilisasi kering
9.	Rak Penyimpanan Media		Berfungsi sebagai tempat untuk menyimpan botol-botol kultur yang berisi media
10.	Timbangan Analitik		Berfungsi untuk menimbang nutrisi yang akan diberikan pada media
11.	Pipet Mikron		Berfungsi untuk mengambil nutrisi yang akan biberikan pada media dalam skala keci (micro)
12.	pH Meter		Berfungsi untuk mengukur pH suatu media
13.	Laminar Air Flow		Berfungsi sebagai alat untuk mensterilisasikan media	Sterilisasi kering

                                                                                                                             

4.2.      Pembahasan

            Botol kultur merupakan tempat untuk mengkulturkan atau menanam eksplan. Cara sterilisasinya yaitu dicuci bersih kemudian dimasukkan dalam oven dan dipanaskan selama 4 jam pada temperatur 160°C. Setelah disterilisasi dapat langsung digunakan. Bila botol akan disimpan untuk beberapa lama maka sewaktu sterilisasi, mulut botol harus ditutup dengan aluminium foil.

            Cawan petridish berfungsi sebagai tempat untuk memotong-motong eksplan yang akan di tanam dalam botol kultur. Cara sterilisasinya yaitu dicuci bersih kemudian dimasukkan dalam oven tetapi terlebih dahulu dibuingkus dengan kertas.

            Oven berfungsi sebagai alat untuk mensterilisasikan alat-alat dengan cara memasukkan alat-alat kultur kedalamnya dengan mengatur tekanan dan waktu yang dibutuhkan dalam sterilisasi tersebut.

            Tabung reaksi digunakan pada saat mengerjakan isolasi protoplas dan isiolasi khloroplas. Cara sterilisasinya yaitu dicuci bersih kemudian dimasukkan dalam oven.

            Autoclave berfungsi untuk mensterilkan bahan atau alat yang pada umumnya terbuat dari logam, plastik, karet, tekstil gelas juga liquid (cairan) dalam keadaan terbungkus maupun tidak. Cara menggunakannya yaitu alat-alat yang digunakan dimasukkan kedalamnya kemudian mengatur tekanan dan waktu yang akan digunakan.

            Kompor listrik untuk pemanas saat memasak media. Alat ini digunakan untuk mengocok media cair sambil dipanasi. Setelah alat ini dihubungkan dengan arus listrik, maka alat ini akan menghomogenkan sekaligus memanaskannya.

Inkubator  berfungsi untuk mensterilisasi alat dan bahan yang akan digunakan dalam praktikum. Cara menggunakannya yaitu memasukkan alat dan bahan kemudian mengatur tekanannya.

Erlenmeyer berfungsi sebagai tempat untuk memanaskan media yang akan dibuat. Cara menggunakannya yaitu mencuci bersih alat tersebut kemudian memasukkan bahan yang akan dibuat media dan selanjutnya dipanaskan pada kompor listrik.

Rak penyimpanan media berfungsi sebagai tempat untuk menyimpan botol-botol kultur yang berisi media. Rak ini juga harus selalu dibersihkan agar tetap steril.

Timbangan analitik berfungsi untuk menimbang nutrisi yang akan diberikan pada media. Timbangan analitik sangat penting dalam kultur jaringan karena memudahkan untuk mengukur nutrisi.

Pipet micron berfungsi untuk mengambil nutrisi yang akan diberikan pada media. Cara menggunakannya yaitu dengan memasukkan alat tersebut ke dalam nutrisi yang akan diambil kemudian mengeluarkannya pada wadah yang berisi media.

pH meter berfungsi untuk mengukur pH suatu media yang dibuat dengan menetralkan alat tersebut kemudian memasukkan ujung alat tersebut pada media yang telah jadi.

Laminar air flow berfungsi sebagai alat untuk mensterilisasikan media. Penggunaan alat ini sangat penting karena digunakan untuk melakukan pembuatan eksplan dan juga pengambilan tanaman mini yang telah jadi dari hasil kultur jaringan.

V. PENUTUP

5.1.  Kesimpulan

            Dari hasil praktikum tersebut dapat disimpulkan bahwa alat-alat tersebut mempunyai fungsi masing-masing.

1.     Botol kultur merupakan tempat untuk mengkulturkan atau menanam eksplan.

2.    Cawan petridish berfungsi sebagai tempat untuk memotong-motong eksplan yang akan di tanam dalam botol kultur.

3.    Oven berfungsi sebagai alat untuk mensterilisasi alat yang akan digunakan dalam media kultur.

4.    Tabung reaksi digunakan pada saat mengerjakan isolasi protoplas dan isiolasi khloroplas.

5.    Autoclave berfungsi untuk mensterilkan bahan atau alat yang pada umumnya terbuat dari logam, plastik, karet, tekstil gelas juga liquid (cairan) dalam keadaan terbungkus maupun tidak.

6.    Kompor listrik untuk pemanas saat memasak media.

7.    Inkubator  berfungsi untuk mensterilisasi alat dan bahan yang akan digunakan dalam praktikum.

8.    Erlenmeyer berfungsi sebagai tempat untuk memanaskan media yang akan dibuat.

9.    Rak penyimpanan media berfungsi sebagai tempat untuk menyimpan botol-botol kultur yang berisi media.

10.  Timbangan analitik berfungsi untuk menimbang nutrisi yang akan diberikan pada media.

11.  Pipet micron berfungsi untuk mengambil nutrisi yang akan diberikan pada media.

12.  pH meter berfungsi untuk mengukur pH suatu media.

13.  Laminar air flow berfungsi sebagai alat untuk mensterilisasikan media.

5.2.  Saran

1.    Untuk laboratorium agar dibersihkan dan dirapikan alat-alatnya

2.    Untuk asisten agar memberikan penjelasan secara detail tentang praktikum ini ke pada para praktikannya