Laporan Praktikum Bioteknologi Pembuatan Media Kultur Jaringan

BAB I

PENDAULUAN

 1.1  Latar Belakang
Media merupakan faktor utama dalam perbanyakan dengan kultur jaringan. Keberhasilan perbanyakan dan perkembangbiakan tanaman dengan metode kultur jaringan secara umum sangat tergantung pada jenis media. Media tumbuh pada kultur jaringan sangat besar pengaruhnya terhadap pertumbuhan dan perkembangan eksplan serta bibit yang dihasilkannya. Oleh karena itu, macam-macam media kultur jaringan telah ditemukan sehingga jumlahnya cukup banyak. Nama-nama media tumbuh untuk eksplan ini biasanya sesuai dengan nama penemunya. Media tumbuh untuk eksplan berisi kualitatif komponen bahan kimia yang hampir sama, hanya agak berbeda dalam besarnya kadar untuk tiap-tiap persenyawaan. Pembuatan media pada prinsipnya dilakukan dengan melarutan semua komponen media dalam air sesuai dengan konsentrasi pada permulasi yang diinginkan, penimbangan komponen media satu persatu untuk setiap pembuatan media kultur tidak praktis dan hanya dapat dilakukan jika jumlah zatnya cukup besar, masalah tersebut dapat diatasi dengan pembuatan larutan stok.
1.2  Tujuan

1. Untuk mengetahui jenis-jenis media kultur
2. Untuk mengetahui sifat dan komposisi pembuatan media
3. Untuk mengetahui teknik aseptic pembuatan media
4. Untuk mengetahui dan memahami rumus perhitungan larutan stok.

1.3  Manfaat
Dari praktikum yang dilakukan diharapkan mahasiswa dapat mengetahui sifat media kultur jaringan dan pemanfaatnya serta mampu membuat media kultur jaringan.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

 2.1 Jenis-jenis Media
a)      Media Knop
Dapat juga digunakan untuk menumbuhkan kalus wortel. Kultur kalus, biasanya ditumbuhkan pada media dengan kosentrasi garam-garam yang rendah seperti dalam kultur akar dengan penambahan suplemen seperti glucosa, gelatine, thiamine, cysteine-HCl dan IAA.
b)      Media White
Dikembangkan oleh Hildebrant untuk keperluan kultur jaringan tumor bunga matahari, ditemukan bahwa unsur makro yang dibutuhkan kultur tersebut, lebih tinggi dari pada yang dibutuhkan oleh kultur tembakau. Unsur F, Ca, Hg dan S pada media untuk tumor bunga matahari ini, sama dengan media untuk jaringan normal yang dikembangkan kemudian. Konsentrasi NO3- dan K+ yang digunakan Hildebrant ini lebih tinggi dari media white, tetapi masih lebih rendah dari pada media-media lain yang umum digunakan sekarang.
c)   Media Knudson dan media Vacin and Went
Media ini dikembangkan khusus untuk kultur anggrek. Tanaman yang ditanam di kebun dapat tumbuh dengan baik dengan pemupukan yang hanya mengandung N dari Nitrat. Knudson pada tahun 1922, menemukan penambahan 7.6 mM NH4+ disamping 8.5 mM NO3-, sangat baik untuk perkencambahan dan pertumbuhan biji anggrek. Penambahan NH4+ ternyata dibutuhkan untuk perkembangan protocorm. Media Nitsch & Nitsch, menggunakan NO3- dan K+ dengan kadar yang cukup tinggi untuk mengkulturkan jaringan tanaman artichoke Jerussalem. Penambahan ammonium khlorida sebanyak 0.1 mM, menghasilkan pertumbuhan jaringan yang menurun. Pertumbuhan sel dari jaringan suatu organ dibandingkan dengan jaringan tumor tanaman Venca rosea (Catharanthus roseus), menunjukkan bahwa penambahan ammonium ke dalam media White yang sudah dimodifikasi, mempunyai pertumbuhan yang lebih baik. Konsentrasi NO3-, NH4-, K+ dan H2PO4- yang diperoleh, hampir sama dengan yang dikembangkan oleh Miller.
d)   Media Murashige & Skoog (media MS)
Merupakan perbaikan komposisi media Skoog, terutama kebutuhan garam anorganik yang mendukung pertumbuhan optimum pada kultur jaringan tembakau. Media MS mengandung 40 mM N dalam bentuk NO3 dan 29 mM N dalam bentuk NH4+. Kandungan N ini, lima kali lebih tinggi dari N total yang terdapat pada media Miller, 15 kali lebih tinggi dari media tembakau Hildebrant, dan 19 kali lebih tinggi dari media White. Kalium juga ditingkatkan sampai 20 mM, sedangkan P, 1.25 mM. Unsur makro lainnya konsentrasinya dinaikkan sedikit. Pertama kali unsur-unsur makro dalam media MS dibuat untuk kultur kalus tembakau, tetapi komposisi MS ini sudah umum digunakan untuk kultur jaringan jenis tanaman lain. Media MS paling banyak digunakan untuk berbagai tujuan kultur pada tahun-tahun sesudah penemuan media MS, sehingga dikembangkan media-media lain berdasarkan media MS tersebut, antara lain media :

1.  Lin & Staba, menggunakan media dengan setengah dari komposisi unsur makro MS, dan     memodifikasi : 9 mM ammonium nitrat yang seharusnya 10mM, sedangkan KH2 PO4 yang dikurangi menjadi 0.5 Mm, tidak 0.625 mM. Larutan senyawa makro dari media Lin & Staba, kemudian digunakan oleh Halperin untuk penelitian embryogenesis kultur jaringan wortel dan juga digunakan oleh Bourgin & Nitsch (1967 dalam Gunawan 1988) serta Nitsch & Nitsch (1969 dalam Gunawan 1988) dalam penelitian kultur anther.
2.   Modifikasi media MS yang lain dibuat oleh Durzan et alI (1973 dalam Gunawan 1988) untuk   kultur suspensi sel white spruce dengan cara mengurangi konsentrasi K+ dan NO3-, dan menambah konsentrasi Ca2+ nya.
3.  Chaturvedi et al (1978) mengubah media MS dengan menurunkan konsentrasi NO3-, K+, Ca2+, Mg2+ dan SO4-2 untuk keperluan kultur pucuk Bougainvillea glabra.

Senyawa-senyawa di dalam media MS dapat terjadi pengendapan persenyawaan, ini terlihat jelas pada media cair. Kebanyakan dari persenyawaan yang mengendap adalah fosfat dan besi, kemudian dalam jumlah yang lebih sedikit adalah Ca, K, N, Zn dan Mn. Senyawa paling sedikit adalah senyawa yang mengandung unsur C, Mg, H, Si, Mo, S, Ca dan Co. Setelah tujuh hari dibiarkan, maka kira-kira 50% dari Fe dan 13% dari PO4+, mengendap (Dalton et al, 1983). Pengendapan unsur-unsur tersebut mungkin tidak penting, karena unsur-unsur tersebut masih tersedia bagi jaringan tanaman dan pengaruh pengendapannya belum diketahui. Untuk mengatasi pengendapan Fe, Dalton dan grupnya menganjurkan supaya konsentrasi Fe dikurangi sampai 1/3 dengan EDTA yang tetap.

5.      Media Gamborg B5 (media B5)
Pertama kali dikembangkan untuk kultur kalus kedelai dengan konsentrasi nitrat dan amonium lebih rendah dibandingkan media MS. Untuk selanjutnya media B5 dikembangkan untuk kultur kalus dan suspensi, serta sangat baik sebagai media dasar untuk meregenerasi seluruh bagian tanaman.. Pada masa ini media B5 juga digunakan untuk kultur-kultur lain. Media ini dikembangkan dari komposisi PRL-4, media ini menggunakan konsentrasi NH4+ yang rendah, karena konsentrasi yang lebih tinggi dari 2 mM menghambat pertumbuhan sel kedelai. Fosfat yang diberikan setelah 1 mM, Ca2+ antara 1-4 mM, sedangkan Mg2+ antara 0.5-3 mM (Gamborg et al, 1968).

6.      Media Schenk & Hildebrant (media SH)
Merupakan media yang juga cukup terkenal, untuk kultur kalus tanaman monokotil dan dikotil. Konsentrasi ion-ion dalam komposisi media SH sangat mirip dengan komposisi pada media Gamborg dengan perbedaan kecil yaitu level Ca2+, Mg2+, dan PO4-3 yang lebih tinggi. Schenk & Hildebrant mempelajari pertumbuhan jaringan dari 37 jenis tanaman dalam media SH dan mendapatkan bahwa: 32 % dari spesies yang dicobakan, tumbuh dengan sangat baik, 19% baik, 30% sedang, 14% kurang baik, dan 5% buruk pertumbuhannya. Tetapi karena zat tumbuh yang diberikan pada tiap jenis tanaman tersebut berbeda. Media SH ini cukup luas penggunaannya, terutama untuk tanaman legume.

7.      Media WPM (Woody Plant Medium)
Yang dikembangkan oleh Lioyd & Mc Coen pada tahun 1981, merupakan media dengan konsentrasi ion yang lebih rendah dari media MS. Media diperuntukkan khusus tanaman berkayu, dan dikembangkan oleh ahli lain, tetapi sulfat yang digunakan lebih tinggi dari sulfat pada media WPM. Saat ini WPM banyak digunakan untuk perbanyakan tanaman hias berperawakan perdu dan pohon-pohon.

8.      Media N6
Media N6 mempunyai ciri perbandingan NH₄⁺ dan NO₃⁻  yang jauh perbandinganya. Amonium  yang diberikan dalam bentuk (NH₄)SO₄ hanya sebanyak 363 mg/l, sedangkan KNO₃ 2830 mg/l.

(Suryowinoto, M. 1991)

2.2 Komposisi dan Fungsi Dasar dalam Media MS
a. Air
Air merupakan komponen yang penting di dalam pengkulturan eksplan karena 95% dari medium mengandung air. Air yang digunakan yaitu air destilasi, dimana air tersebut telah steril dari kontaminasi mikroorganisme atau substansi yang dapat merusak proses perkembangan eksplan.
b. Larutan garam anorganik
Tiap tanaman memerlukan setidaknya 6 elemen mikronutrien N, P, K, Mg, Ca, S, dan elemen yaitu Fe, Mn, B, Mo, Cl. Pereduksi CU^2- menjadi Cu^- bermanfaat pada perkembangan dan perbaikan vitamin adalah bahan yang perlu ditambahkan sebab tumbuhan yang dikulturkan belum mampu membuat vitamin sendiri, biasanya yang ditambahakan yaitu vitamin B, asam nukleat, pridosin (vitamin B6).
c. Zat-zat organic
Senyawa organic yang dipakai yaitu karbohidrat yang tersusun atas unsur-unsur C, H, O sebagai elemen penyusun utama karbohidrat mempunyai fungsi utama yaitu sebagai sumber energy untuk keseimbangan tekanan osmotic.

(Sanawaria, 2008)

 2.3 Teknik Aseptik dalam Pembuatan Media
a. Sterilisasi peralatan

• Sterilisasi peralatan (glassware dan logum) dan aquades dilakukan dengan sterilisasi kering (oven 130⁰c-170⁰c selama 2-4 jam).
• Sterilisasi peralatan dengan autoclave dilakukan pada suhu 121⁰c takanan 15 PSI selama 1 jam.
• Sterilisasi peralatan logam (pinset, gunting, jarum) yang digunakan dengan merendam perakitan tsb dalam alcohol 95% diikuti dengan pembakaran dan pendinginan.

b. sterilisasi medium kultur

• Metode autoclave

Medium dalam botol kultur ditutup dengan alumunium foil pada suhu 121⁰ C, tekanan PSI selama 15-40 menit dari waktu medium mencapai suhu yang diperlukan.

• Metode Filtrasi

Yaitu sterilisasi menggunakan membrane filter berukuran 0,45-0,22 mm di dalam kontiener steril.

(Sriyanti, 1994)

2.4 Rumus Perhitungan Larutan Stok
Volume stok untuk setiap pembuatan media q liter.

 V₁ X M₁ = V₂ x M₂

 Ket: V1 = Volume stok yang dicari.
V2 = Volume larutan stok
M1 = Konsentrasi larutan stok
M2 = Konsentrasi yang diinginkan.

(Hemawan dan Na”em, 2006)

BAB III

METODOLOGI

3.1  Alat, Bahan dan Fungsi

• Alat :

1. 14 botol kultur : berfungsi sebagai tempat media kultur
2. 2 pak karet gelang : berfungsi untuk penutup atau tali penutup plastik dan alumunium
3. Plastik tahan tanas (untuk 8 botol, dengan ukuran pxl; 12 x 13 cm) : sebagai penutup botol kultur (perlakuan a)
4. Gelas ukur : untuk mengukur cairan yang di butuhkan
5. Mikro pipet : untuk mengambil larutan stok dengan ukuran terkecil mikro meter
6. Beaker glass : untuk tempat pembuatan larutan stok
7. pH universal (indikator pH) : untuk mengukur pH larutan
8. sitter : megaduk larutan
9. microwave : untuk memasak larutan hingga larutan mengental
10. alumanium foil (unutk 6 botol, dengan ukuran pxl; 24 x 15, kertas di lipat/rangkap) : sebagai penutup botol kultur (perlakuan b)
11. autoclave : sterilisasi botol kultur sebelum di masukkan ke ruangan pengamatan
12. Timbangan analitik : untuk menimbang berat bahan yang diperlukan
    1. Oven : sterilisasi kering botol kultur

• bahan :

1. Aquades        : 50 ml (bahan tambahan pada

larutan stok)

1. Makro             : 30 ml

Mikro A          : 3 ml
Mikro B          : 0,3 ml                      sebagai bahan
FeEDTA          : 3 ml                         pembuatan larutan stok
Vitamin          : 0,3 ml
CaCl₂                        : 3 ml

1. Sukrosa                                  : untuk 300 ml. Larutan media

digunakan 9 gram gula. (untuk
membuat larutan menjadi
tercampur rata)

1. Agar-agar                              : unutk 300 ml. Larutan media

digunakan 2,1 gram agar-agar
(untuk mengentalkan larutan)
3.2          Cara Kerja Pembuatan Media Kultur (Diagram Alir)

Bilas gelas dengan menggunakan aquades

Isi gelas dengan aquades kurang lebih 50 ml

Masukkan sukrosa (gula) 9 gram dan agar-agar 2,1 gram                                                                                    Agar-agar            : 2,1 gram

Stirer (aduk) beberapa menit sampai larutan berwarna bening

Tutup dengan plastik wrap dan di lubangi

Mikrowave selama 7 menit

Masukkan ke dalam botol kultur @20 ml : 8 botol dengan tutup plastik 6 botol dengan tutup alumunium

Autoclave

Tambahkan aquades hingga volume mencapai 300 ml

Stirer (aduk) dan ukur pH (pH indikator)

Tambahkan unsur-unsur yang sudah di stok                       Makro   : 30 ml, Mikro A : 3 ml, Mikro B   : 0,3 ml, Fe EDTA     : 3 ml, Vitamin   : 0,3 ml, CaCl2        : 3 ml

3.3 Analisis perlakuan
Sebelum pembuatan media hal yang pertama kali dilakukan adalah mensterilkan semua peralatan yang akan digunakan dengan alcohol 95% serta diiuti dengan pembakaran kemudian didinginkan, hal ini bertujuan agar alat tidak terkontaminasi dengan jamur atau bakteri.
Isi breaker glas dengan larutan aquades kurang lebih 50 ml. Setelah itu, tambahkan unsur-unsur larutan yang sudah di stok, yaitu : makro (30 ml), mikro A (3 ml), mikro B (0,3 ml), Fe EDTA (3 ml), Vitamin (0,3 ml) dan CaCl₂ (3 ml). Setelah semua larutan selesai ditambahkan, tambahkan lagi aquades hingga volume mencapai 300 ml. Stirer (aduk) larutan dan ukut pH larutan menggunakan indikator pH hingga mencapai pH sekitar 5 – 6. Masukkan sukrosa (9 gram) dan agar-agar (2,1 gram) yang bertujuan untuk melarutkan larutan dan mengentalkan larutan. Stirer kembali sampai larutan berwarna putih bening. Setelah selesai, tutup breaker glas dengan plastik wrap dan masukkan ke dalam microwave selama 7 menit setelah selesai, masukkan larutan ke dalam botol kultur dengan 8 botol di tutup plastik, dan 6 botol ditutup alumunium. Masukkan ke autoclave untuk sterilisasi akhir, dan amati selama 2 minggu, apakah terjadi kontaminasi atau tidak, catat hasil.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1  Hasil

1. a.      Tabel media kultur dengan penutup plastic

NO	Hari Pengamatan ke-	Botol ke-	Jenis Kontaminan	Keterangan
1.	Kamis, 11 oct 2012	1 2 3 4 5 6 7 8	-	Tidak ada yang terkontaminasi
2.	Kamis, 18 oct 2012	1 2 3 4 5 6 7 8	-	Tidak ada yang terkontaminasi
3.	Selasa, 23 oct 2012	1 2 3 4 5 6 7 8	-	Tidak ada yang terkontaminasi
4.	Rabu, 31 Oct 2012	1 2 3 4 5 6 7 8	-	Tidak ada yang terkontaminasi
5.	Jum’at, 02 Nop 2012	1 2 3 4 5 6 7 8	-	Tidak ada yang terkontaminasi

1. b.      Tabel media kultur dengan penutup alumunium poli

NO	Hari Pengamatan ke-	Botol ke-	Jenis Kontaminan	Keterangan
1.	Kamis, 11 oct 2012	1 2 3 4 5 6	-	Tidak ada yang terkontaminasi
2.	Kamis, 18 oct 2012	1 2 3 4 5 6	-	Tidak ada yang terkontaminasi
3.	Selasa, 23 oct 2012	1 2 3 4 5 6	-	Tidak ada yang terkontaminasi
4.	Rabu, 31 Oct 2012	1 2 3 4 5 6	-	Tidak ada yang terkontaminasi
5.	Jum’at, 02 Nop 2012	1 2 3 4 5 6	-	Tidak ada yang terkontaminasi

4.2  Pembahasan
Pada praktikum kali ini kita kita mencoba membuat media kultur jaringan dengan bahan-bahan yang sudah dijelaskan di atas, setelah di autoklaf kita mengamati perkembangan media pada hari kamis tanggal 11 oktber, disana terlihat bahwa media yang ditutup dengan plastic dan alumunium poli keadaan semuanya masih baik, dengan tanda-tanda tidak ada perubahan warna (tetap putih) dan juga masih kelihatan stabil dengan kata lain tidak terlihat danya jamur pathogen yang masuk.
Kemudian pada hari kamis tanggal 18 oktober kita mengamati lagi dan ternyata tidak jauh berbeda dengan yang pengamatan pertama jadi semua media baik 8 sample yang ditutpi plastic dan 6 sample yang ditutupi alumunium tidak ada tanda-tanda terkontaminasi, tetapi disini ada satu media yang tertutupi alumunium yang kelihatan warnanya agak kekuningan tetapi menurut saya masih dalam keadaan tidak terkontaminasi karena ketika begitu sample didekatkan warnanya masih putih sebenarnya cuma memang dari jauh kelihatan agar sedikit kekuningan, seandainya itu termasuk dalam tanda kontaminasi tidak mungkin sebab saya melihat sample praktikan lain ada yang kuning tetapi disitu ada jamur yang menggelembung (membentuk bundaran) yang berwarna hitam ke abu-abuan, sedangkan pada sample kami tidak sedemikian itu.
Begitupun pada pengamatan ke-3 pada hari selasa tanggal 23 oktober 2012 kami menyimpulkan tidak ada yang terkontaminasi, begitu juga pada saat pengamatan ke-4 hari rabu, tanggal 31 oct 2012. Hingga pada pengamatan yang terakhir pada hari jum’at tanggal 02 nop 2012, ke 8 sample media kultur jaringan yang ditutupi plastic tidak terlihat adanya kontainasi begitupun ke 6 sample yang ditutupi alumunium.
Seperti apa yang dikemukakan oleh Andria bin Muhayat bahwa “eksplan yang terkontaminasi akan menunjukkan gejala seperti berwarna putih sampai biru (disebabkanjamur) atau busuk (disebabkan bakteri)

BAB V

PENUTUP

5.1 Kesimpulan
Media merupakan faktor utama dalam perbanyakan dengan kultur jaringan. Keberhasilan perbanyakan dan perkembangbiakan tanaman dengan metode kultur jaringan secara umum sangat tergantung pada jenis media. Media MS mengandung 40 mM N dalam bentuk NO3 dan 29 mM N dalam bentuk NH4+. Dan Media MS inilah yang paling banyak digunakan untuk berbagai tujuan kultur pada tahun-tahun sesudah penemuan media MS.

Pada praktikum kali ini kita mencoba membuat media tanam kultur jaringan dengan jenis media MS tersebut, dan akhirnya dapat ditarik kesimpulan ketika kita sudah melakukan beberapa kali pengamatan, media kultur jaringan yang ditutup dengan plastic biasa tepatnya ada 8 sampel dan 6 sampel yang ditutupi alumunium foil semuanya tidak terkontaminasi, masih putih normal

DAFTAR PUSTAKA

• Herawan, T dan M. Na’iem. 2006. Pengaruh Jenis Media dan Konsentrasi Zat Pengatur Tumbuh Terhadap Perakaran pada Kultur Jaringan Cendana (Santalum album Linn.). Jurnal Agrosains 19(2) : 103-109.
• Sasnawaria, 2005. Mikrobiologi dasar. Papa sinar sinantris. Jakarta.
• Sriyanti, Daisy P. 1994. Teknik Kultur Jaringan. Kanisius. Yogyakarta.
• Suryowinoto, M. 1991. Budidaya Jaringan dan Manfaatnya. Fakultas Biologi. Universitas Gadjah Mada. Yogyakart